Чалфи принадлежит к третьему поколению иммигрантов из Российской империи. Окончил среднюю школу в Чикаго, затем Гарвардский университет (1969). Там же в 1977 г. получил докторскую степень по нейробиологии. С 1982 г. - профессор Колумбийского университета. Работает в области клеточной дифференциации, изучает развитие функции нервных клеток круглых червей (нематод). Чалфи разработал новые экспериментальные методы этих исследований. Он был первым, кто доказал возможность использования зеленого свечения протеина GFP в качестве светового маркёра для исследования различных биологических явлений. В 1996 г. Чалфи создал голубой мутант зеленого белка, которым окрасили нематоду. Мартин Чалфи опубликовал более 200 научных работ, он член Национальной академии наук США (с 2004 г.). В 2006 г. ему была присуждена премия Розенталя за выдающиеся достижения в области медицины. А в 2008 г. Чалфи стал лауреатом Нобелевской премии по химии (вместе с Осамой Симомура и Роджером Цянем) "за открытие и развитие использования зелёного флуоресцентного белка (GFP)".

Имя Мартин - английская форма римского имени Martinus, происходящего от имени бога войны Марса. Фамилия Чалфи (Халфи) происходит, вероятно, от ивритского слова хальфан, которое означает "меняла".