В 1912 г. Штерн окончил Университет Бреслау (ныне Вроцлав). Работал с Эйнштейном в университетах Праги и Цюриха. Преподавал теоретическую физику в университетах во Франкфурте (1914-21) и Ростоке (1921-22). В 1923-33 гг. - профессор физической химии и директор лаборатории в Гамбургском университете.

После прихода нацистов к власти в 1933 г. Штерн эмигрировал в США, был профессором физики Технологического института Карнеги в Питсбурге, Пенсильвания, а с 1945 г. - в Калифорнийском университете в Беркли.

Основные исследования Штерна относятся к термодинамике, молекулярной физике и квантовой теории. Он внес также существенный вклад в экспериментальную физику. В 1920 г. Штерн впервые провёл опыт по определению скоростей теплового движения молекул газа, подтвердивший правильность молекулярно-кинетической теории вещества.

В 1922 г. Штерн (вместе с В. Герлахом) разработал метод молекулярных пучков и применил его для исследования поведения атомов в магнитном поле, открыв при этом явление пространственного квантования (опыт Штерна - Герлаха). В 1933 г. он впервые измерил магнитный момент протона в молекуле водорода. За эту работу он в 1943 г. был удостоен Нобелевской премии по физике.

Штерн был действительным членом Национальной академии наук США, Американской ассоциации по развитию науки, членом нескольких иностранных академий. 

Имя Отто происходит от германского корня aud - "богатство". Фамилия Штерн происходит от немецкого слова Stern, которое означает "звезда".

Вне Нью-Йорка

- Мемориальные доски в честь Отто Штерна установлены в Гамбургском университете и в г. Жоры (Гурны Шлёнск, Польша, 1998).

- Памятный знак установлен на Бульваре Нобелевских Лауреатов в Ришон ле-Ционе, Израиль.