Родители Дастина, потомки еврейских эмигрантов из Российской империи, не были религиозны. Мать начала давать сыну уроки музыки с пяти лет. В 1955 г. Хоффман закончил среднюю школу в Лос-Анджелесе, год проучился в колледже, затем поступил на актёрские курсы при одном из старейших государственных театров Калифорнии - "Пасадена Плэйхаус".

Спустя два года в поисках лучшего приложения своего таланта Хоффман уезжает в Нью-Йорк, где первое время перебивается случайными заработками: работает в ресторане, снимается в рекламе и т.п. В 1961 г. Дастину Хоффману удаётся поступить в знаменитую Актёрскую студию и продолжить изучать актёрского искусства у Ли Страсберга и Элиа Казана.

В середине 60-х актёр снялся в нескольких телевизионных сериалах. Первым его успехом на сцене была роль в пьесе «Eh?» британского режиссёра Г. Ливингса (1966). Открытие таланта Хоффмана в кинематографе приписывают продюсеру Сиднею Пинку. Побывав на спектаклях с участием Хоффмана, он предложил актёру роль в своём фильме "Madigan's Millions" (1968). За его работу в фильме "Выпускник" Хоффман был отмечен премией "Золотой глобус" за лучший дебют, а также номинирован на Оскара за лучшую мужскую роль.

Следующий неоспоримый успех достигнут актёром в роли маленького несчастного афериста Крысёныша в фильме "Полуночный ковбой" (1969). Сам фильм и актёрский дуэт Хоффмана и Джона Войта был отмечен большим количеством наград. После этого на Хоффмана появляется ажиотажный спрос, он начинает сниматься не менее, чем в одном фильме в год. 1979 год принёс Хоффману главную роль в фильме "Крамер против Крамера" и ожидаемого Оскара за лучшую мужскую роль. Фильм был номинирован на различные кинопремии в различных номинациях более 50 раз, из них в 35 одержал победу.

Фильм Сидни Поллака "Тутси" (1982) имел большой успех в прокате, был включён в "100 лучших американских фильмов за 100 лет". Дастин Хоффман получил за роль Дороти сразу несколько кинематографических наград, включая "Золотой глобус" и премию "Лучший актёр года". Крупный успех выпал на долю фильма Барри Левинсона "Человек дождя" (1988) - во многом благодаря актёрскому таланту Хоффмана. За роль больного аутизмом Рэймонда Бэббита он получил второго Оскара и пятый "Золотой глобус".

С начала девяностых Дастин Хоффман снимается в картинах разных жанров: в экранизации комиксов "Дик Трейси" (1990) совместно с Аль Пачино; в гангстерской саге "Билли Батгейт" (1991) совместно с Николь Кидман; в сказке, по-новому переосмысленной Стивеном Спилбергом "Капитан Крюк" (1991); в фильме катастроф "Эпидемия" (1995); в криминальной драме "Спящие" (1996). Эти фильмы имели неплохой коммерческий успех, но эксплуатировали в первую очередь популярность актёра, а не его драматическое мастерство.

Иначе прозвучал в 1997 г. фильм "Плутовство" Барри Левинсона. Сатирическая комедия на грани чёрного юмора с запоминающимимся образами Хоффмана и Де Ниро была номинирована на многочисленные кинопремии, но принесла только специальный приз Берлинского кинофестиваля. Среди последних по времени фильмов Хоффмана - триллер по одноимённому роману Патрика Зюскинда "Парфюмер: История одного убийцы" (2006), драма "Последний шанс Харви" (2008) и др.
 

Имя Дастин произошло от древнескандинавской фамилии Thorsteinn, означающей "камень (бога) Тора". Имя Ли восходит к фамилии американского генерала Роберта Ли (1807-1870), которая в свою очередь происходит от староанглийского слова leah - "луг". Фамилия Хоффман образована от немецких слов hoffen - "надеяться" и Mann - "человек".